人肝素酶基因正反义荧光真核表达载体的构建及肝癌细胞转染

目的　　构建正义和反义人肝素酶绿色荧光蛋白真核共表达载体,并分别转染人低转移肝癌细胞株MHCC97－L及高转移细胞株MHCC97－H和HCCLM6。方法　　采用基因重组技术,用EcoRⅠ从pcDNA3－Hpa质粒上切下约1．7kb的人肝素酶全长cDNA片段,然后连入pIRES2－EGFP质粒的EcoRⅠ酶切位点上,经BamHⅠ酶切鉴定出正义和反义表达载体,并进一步测序确认。用脂质体法将肝素酶正义真核表达载体转入人低转移肝癌细胞株MHCC97－L,反义真核表达载体转入人高转移肝癌细胞株MHCC97－H和HCCLM6,24h后荧光倒置显微镜下检测转染结果。结果　　经BamHⅠ酶切后,正义质粒形成5．3kb和1．7kb两条DNA片段,而反义重组质粒为6．5kb和0．5kb两条DNA片段,与理论计算值完全一致；测序结果进一步确认了方向的正确性。转染成功的肝癌细胞在倒置荧光显微镜下呈绿色荧光。结论　　成功构建了人肝素酶的正、反义真核表达载体,并成功转染人低、高转移肝癌细胞株,为进一步研究正、反义肝素酶基因转染对肝癌细胞的转移能力的影响奠定了基础。