人胱抑素C的原核表达纯化鉴定及抗血清的制备

目的构建人胱抑素C（cystatinC,CysC）的原核表达载体，并用纯化的CysC重组蛋白免疫家兔，制备CysC抗血清。方法从HL-60细胞中提取总RNA，RT-PCR扩增CysC基因，将测序正确的目的基因克隆至pET32(a)表达载体中，并诱导其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达；所获得的包涵体蛋白经亲和层析纯化、透析复性、Westernblot鉴定后，免疫家兔制备抗血清，抗体效价和特异性分别采用ELISA、Westernblot进行检测。结果测序证实克隆的基因序列与GeneBank中的CysC序列相符；SDS-PAGE、Westernblot结果证实获得相对分子质量为35×103的CysC融合蛋白，其表达形式为不溶性包涵体；此包涵体蛋白经Ni2+亲和层析能有效纯化，以该蛋白免疫家兔制备抗血清，抗体效价为？1∶8000？，Westernblot检测证实该抗体能与目的蛋白发生特异性结合。结论获得了CysC重组蛋白及特异性多克隆抗体。