促凋亡因子Smac/DIABLO与核受体NR4A1相互作用的筛选和鉴定

目的利用酵母双杂交技术筛选线粒体促凋亡因子野生型Smac/DIABLO的相互作用蛋白。方法①设计促凋亡因子野生型Smac/DIABLO引物，利用PCR在成人肝cDNA文库中扩增野生型Smac/DIABLO基因片段，构建酵母真核表达载体pDBLeu-Smac/DIABLO。②pDBLeu-Smac/DIABLO诱饵质粒转化酵母MaV203,Westernblot检测融合蛋白在酵母中的正确表达，自激活作用的检测并确定抑制His基础表达的3AT浓度。③对成人肝cDNA文库的筛选。选择能同时激活His、Ura、LacZ3个报告基因的克隆为阳性，利用回转实验和GST-pulldown对阳性克隆进行鉴定。结果成功构建pDBLeu-Smac/DIABLO载体，转化酵母细胞MaV203，无细胞毒性，无自激活作用，3AT浓度为25mmol/L。经回转实验和GST-pulldown证实了线粒体促凋亡因子Smac/DIABLO与核受体NR4A1之间具有相互作用。结论Smac/DIABLO可能通过与核受体NR4A1的相互作用来影响核受体NR4A1对细胞生存或者凋亡的调控。