TAT-Smad7-HA融合蛋白的表达及其转导活性验证

目的构建、表达、纯化、鉴定并标记TAT-Smad7-HA融合蛋白，验证其在体外培养的人原代瘢痕疙瘩成纤维细胞（keloidfibroblastcell,KFB）中的转导活性。方法分别将TAT-PTD、Smad7基因和HA片段依次连接入pET32a(+)质粒构建成pTAT-Smad7-HA重组原核表达载体，IPTG诱导表达后经亲和纯化、Westernblot验证、肠激酶切割、目的片段回收和FITC标记后，将FITC-TAT-Smad7-HA融合蛋白作用于体外培养的人原代KFB以观察其转导活性。结果成功构建了TAT-Smad7-HA融合蛋白的原核表达载体pTAT-Smad7-HA,目的蛋白在诱导后获得了高效表达（占菌体总蛋白的25％以上），并成功进行了纯化（纯度达95％以上）、脱盐柱脱盐、Westernblot验证、硫氧环蛋白切除及FITC标记，得到相对分子质量约为50×103的FITC-TAT-Smad7-HA融合蛋白,并进一步在体外培养的人KFB细胞中证实了其高转导活性。结论本实验获得了高纯度的FITC-TAT-Smad7-HA融合蛋白，并验证了其在KFB中的高转导活性。