细胞死亡调控基因GRIM19重组腺病毒的构建及在恶性胶质瘤CHG-5细胞中的表达

目的构建细胞死亡调控基因GRIM19(genesassociatedwithretinoid-IFN-inducedmortality19)重组腺病毒载体，观察GRIM19对病毒包装细胞是否具有细胞毒作用，并验证其对脑胶质瘤CHG-5细胞的感染效率。方法采用PCR方法分别将GRIM19以及EGFP基因亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV,在BJ5183（pAdeasy）菌内同源重组,筛选阳性克隆,酶切测序鉴定,线性化后转染293T细胞进行包装、扩增、纯化，PCR检测病毒上清，TCID50法测定病毒滴度并感染CHG-5细胞后Western免疫印迹法验证GRIM19蛋白表达。结果连接重组后经酶切和测序法筛选出pAd-GRIM19;转染293T包装细胞，观察到绿色荧光蛋白(GFP)明显表达，细胞生长状态良好，未见明显细胞毒作用。Ad-GRIM19及Ad-EGFP初纯病毒经氯化铯梯度离心纯化最终获得约5×1010U/ml与8×1010U/ml滴度的重组病毒;将其体外感染胶质瘤CHG-5细胞，均能达到90%左右的感染率，Western免疫印迹法表明Ad-GRIM19感染组GRIM19蛋白表达明显升高。结论成功构建了携带GRIM19基因的重组腺病毒，为体内外进一步研究GRIM19对脑胶质瘤的作用奠定了基础。