慢病毒载体介导的增强型绿色荧光蛋白转基因小鼠的建立

目的以慢病毒作为载体，制作增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转基因小鼠，建立慢病毒介导的转基因动物制备技术平台。方法慢病毒包装采用三质粒系统。3个质粒分别为转基因质粒FUGW、病毒结构蛋白表达质粒psPAX2以及病毒包膜蛋白表达质粒pMD2.G。病毒包装时，用磷酸钙沉淀法将三质粒共转染来源于人胚肾细胞系的293FT细胞，培养48h后，收取含病毒的上清，并通过高速离心浓缩病毒。将含浓缩病毒液作梯度稀释后感染293FT细胞，通过流式细胞计数仪测定病毒滴度。用显微注射法将浓缩的病毒液注射至FVB/N小鼠1-细胞期胚胎透明带下。在荧光显微镜下观察胚胎EGFP的表达。将注射后发育至2-细胞期的胚胎移植至假孕受体母鼠，得F0代小鼠。通过紫外光照射观测EGFP在小鼠活体内的表达水平。结果病毒液浓缩前的滴度≥106TU/ml(transducingunit,TU)，经过高速离心对病毒进行浓缩和纯化，其滴度达到109TU/ml以上。将浓缩病毒液注射至小鼠1-细胞期胚胎透明带下，注射后胚胎的2-细胞期卵裂率为81.8%(1189/1453)，利用荧光显微镜分别在注射后60、84、132h观察胚胎，均发现有较强荧光。在2-细胞期，每一视野下胚胎阳性率＞90%，说明包装的病毒成功并高效地转染小鼠胚胎。胚胎移植后假孕母鼠妊娠率为42.9%(12/28)，首建鼠阳性率为60.8％(73/120)，转基因小鼠的总体研制效率（转基因小鼠数/注射胚胎数）为5.0%(73/1453)。将F0代EGFP转基因小鼠分别与野生型小鼠交配，在其F1、F2、F3代小鼠中均获得了EGFP阳性小鼠，阳性率分别为91.4%(32/35)、93.8%(30/32)、93.1%(27/29)。结论通过慢病毒载体感染小鼠1-细胞期胚胎可有效地制备转基因小鼠。我们已初步建立了慢病毒介导的转基因小鼠制备技术体系。