端粒酶逆转录酶启动子hTERT/U6嵌合启动子的siRNA表达载体的构建及鉴定

目的〖HTSS〗构建有hTERT/U6嵌合启动子的小干扰RNA（smallinterfereRNA,siRNA）表达载体，并用分子生物学的技术和方法验证其对肝癌细胞SMMC-7721的效应。方法构建siRNA-EGFP-PTZU6+1表达载体，将其转染到稳定表达EGFP的肝癌细胞株7721(EGFP-7721)，观察细胞荧光的变化及RT-PCR，Westernblot筛选出更有效的siRNA-EGFP-PTZU6+1载体。PCR扩增端粒酶逆转录酶（humantelomerasereversetranscriptasepromoter,hTERT）启动子的核心序列，构建针对EGFP基因的hTERT/U6嵌合启动子siRNA表达载体(EGFP-siRNA-PTZU6+1-U6/hTERT)，正向和反向插入的hTERT启动子各1个，并将其转染至EGFP-7721细胞中，RT-PCR验证其效应。结果RT-PCR，Westernblot结果表明两重组质粒siRNA-EGFP-PTZU6+1转染EGFP-7721细胞后EGFP基因的表达无统计学差异，但与对照组比较均显著抑制了EGFP基因(P<0.01)。而且，RT-PCR结果显示，反向插入的重组质粒EGFP-siRNA-PTZU6+1-U6/hTERT与对照组相比显著抑制了EGFP基因的表达(P<0.05)。结论构建的含hTERT/U6嵌合启动子的siRNA表达载体在肝癌细胞中具有功能活性，为探讨基因的靶向治疗奠定了基础。