穿膜肽TAT-p38αG融合基因的构建、表达及穿膜特性的鉴定

目的构建穿膜肽TAT-p38αG融合基因，进行原核表达及穿膜特性鉴定。方法提取人EVC304细胞总RNA，巢式PCR扩增p38αG基因片段，T-A克隆，测序证实片段无误后，将p38αG基因片段亚克隆入原核表达载体pTAT-HA,获得pTAT-p38αG融合基因表达载体。将表达载体转化大肠杆菌，IPTG诱导表达获得TAT-p38αG融合蛋白，并行Ni？NTA柱过柱和超滤纯化，抗His抗体免疫印迹法鉴定。采用荧光素FITC体外标记TAT-p38αG融合蛋白，与EVC304细胞共培养，荧光显微镜下观察其穿膜特性。结果成功构建了融合基因原核表达载体pTAT-p38αG，并表达出大小约30×103的蛋白产物，与融合蛋白TAT-p38αG理论计算值相符。细胞实验结果显示，TAT-p38αG能呈浓度依赖性方式转导进入EVC304细胞。结论TAT-p38αG融合蛋白具有良好的穿膜特性，研究为下一步鉴定TAT-p38αG融合蛋白对p38α激酶的抑制作用奠定了良好的实验基础。