含hTERT启动子和Fcy::Fur基因重组质粒的构建及其对卵巢癌细胞的体外杀伤作用

目的构建含人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子和融合型自杀基因Fcy::Fur的重组真核表达质粒并探讨它对卵巢癌细胞的体外杀伤作用。方法①从pORF5-Fcy::Fur质粒中PCR扩增Fcy::Fur片段，亚克隆进p2XEB质粒，构建含hTERT启动子和Fcy::Fur基因的重组真核表达质粒p2XEB-Fcy::Fur；同理，将Fcy::Fur亚克隆进pGL3-Promoter质粒，构建含猿猴病毒40（SV40）启动子和Fcy::Fur基因的重组质粒pGL3-Pro-Fcy::Fur，重组子经酶切鉴定、测序；②RT-PCR检测卵巢癌细胞SKOV3和人胚肺成纤维细胞MRC-5中hTERTmRNA的表达，荧光素酶活性分析检测hTERT启动子在2种细胞中活性；③用超声微泡作载体，将上述2种质粒分别转染SKOV3和MRC-5,与前药5-氟胞嘧啶（5-FC）共培养后，CCK-8测定转染细胞增殖抑制率；吖啶橙/溴化乙啶（AO/EB）染色观察细胞凋亡；RT-PCR检测Fcy::FurmRNA的表达。结果p2XEB-Fcy::Fur和pGL3-Pro-Fcy::Fur2种重组质粒酶切和测序结果与预期完全相符，hTERT启动子和Fcy::Fur片段测序与GenBank报道一致,且插入方向正确；SKOV3和MRC-5中hTERTmRNA表达分别为阳性和阴性，hTERT启动子在SKOV3中活性为26.2％，在MRC-5中为0.65％；p2XEB-Fcy::Fur/5-FC系统对SKOV3的增殖抑制率明显高于MRC-5（P=0.036），而pGL3-Pro-Fcy::Fur/5-FC系统对2种细胞的增殖抑制率无明显区别（P=0.87）；转染pGL3-Pro-Fcy::Fur的SKOV3、MRC-5细胞以及转染p2XEB-Fcy::Fur的SKOV3细胞，均见大量凋亡细胞和Fcy::FurmRNA表达，而转染p2XEB-Fcy::Fur的MRC-5少见凋亡细胞，也无Fcy::FurmRNA表达，与前三者比较，差异有统计学意义（P<0.01）。结论含人端粒酶逆转录酶启动子和Fcy::Fur基因的重组质粒p2XEB-Fcy::Fur成功构建，p2XEB-Fcy::Fur/5-FC系统能靶向杀伤端粒酶逆转录酶阳性的卵巢癌细胞。