人APOEε2及ε4等位基因修饰的神经干细胞的建立

目的构建APOEε2和APOEε4的真核表达载体，转染APOE敲除鼠神经干细胞，分别建立转染APOEε2和ε4的神经干细胞系。方法以前期克隆得到的APOEε3cDNA为基础，通过定点突变技术得到APOEε2和APOEε4cDNA，亚克隆入表达载体pEGFP-N1，构建pEGFP-N1-APOEε2及pEGFP-N1-APOEε4的真核表达载体，经双酶切和测序确定序列及阅读框正确。以脂质体转染法转染APOE敲除鼠神经干细胞，通过G418筛选，建立转染APOEε2和ε4的神经干细胞系。采用RT-PCR、Westernblot及免疫荧光法检测APOE的表达。结果APOE敲除鼠NSCs转染6h后发出绿色荧光，48h达到高峰，荧光显微镜下观察转染率约（40.0±2.3）%，转染pEGFP-N1-APOE的NSCs在筛选至第10天可见细胞克隆形成。经鉴定保持了自我更新、多向分化保持性，其中分化为神经元的比例为（32.15±2.61）%，各组之间无明显差异。结论成功构建了稳定表达源性APOEε2及ε4的神经干细胞克隆，相应等位基因修饰的神经干细胞能高效表达目的基因蛋白并保留其干细胞特性。