大鼠促红细胞生成素重组腺病毒载体的构建及其在大鼠SGNs中的表达

目的构建大鼠促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）重组腺病毒载体，并转染于体外培养的大鼠螺旋神经元（spiralganglionneurons,SGNs）。方法全基因合成大鼠EPO基因，亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV，构建重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-EPO。经酶切、PCR及测序鉴定，再经PacⅠ酶切线性化后电转化感受态细胞，获得重组腺病毒载体pAdTrack-CMV-EPO，经PacⅠ酶切后转染至293细胞进行包装，制备重组腺病毒，扩增后进行病毒滴度测定及RT-PCR和Westernblot鉴定。并转染至体外培养的螺旋神经元，免疫荧光检测及蛋白水平检测螺旋神经元中EPO表达。结果经KpnⅠ、HindⅢ酶切与测序鉴定显示，腺病毒载体pAdTrack-CMV-EPO构建成功，重组腺病毒AdEPO在293细胞中成功包装，扩增后病毒滴度为1.17×1011U/ml；经RT-PCR和Westernblot检测EPO在293细胞中成功表达。重组腺病毒载体AdEPO经鉴定均构建正确；免疫荧光及Westernblot检测转染腺病毒后螺旋神经元中EPO表达显著增强。结论成功构建了EPO重组腺病毒载体，并成功转染螺旋神经元，可显著增强螺旋神经元中EPO表达水平。