多基因真核表达载体的构建及其产物的亚细胞定位

目的构建一种多基因表达载体，实现同一载体单一启动子的调控下表达多个基因以及这些基因在同一细胞不同细胞器中的定位。方法利用存在于某些病毒核酸序列中的不同2A肽，合成1段包括2个2A肽和不同限制性内切酶位点的多肽序列，形成单一的开放读码框，插入真核表达载体pcDNA3.1(－)Myc/His(B)相应的多克隆位点中，然后将带有膜定位的红色荧光蛋白（ERFP）、核定位的绿色荧光蛋白（EGFP）和胞浆定位的黄色荧光蛋白（EYFP）顺序插入2A肽之间的位点中，构建多基因真核表达载体pcDNA3.1RGY。用脂质体转染小鼠成纤维NIH3T3细胞和人肾胚293细胞，利用流式细胞仪、荧光显微镜和共聚焦显微镜检测各种荧光蛋白的表达和亚细胞定位。结果转染24h后用流式细胞仪检测，可同时检测到EGFP和ERFP的表达，且两种荧光蛋白的表达率十分接近；荧光显微镜下同时观察到绿色和红色荧光；共聚焦显微镜观察到在单一细胞上同时显示3种荧光，ERFP定位在细胞膜上，EGFP在细胞核中，而EYFP在细胞质中。结论通过串联方式将多个2A肽和基因置于同一个开放读码框中可实现在同一启动子的调控下表达多个基因。此外，在每个基因序列中加入不同的信号肽序列可将相应基因同时靶向不同的细胞器，实现同一细胞中不同的亚细胞定位。