TRADD慢病毒载体构建及其对增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响

目的构建抗食管支架术后再狭窄携人TRADD基因慢病毒表达载体，并检测其对增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响。方法以购买的人TRADD基因为模板，采用PCR法扩增目的基因片段，PCR产物经回收纯化后与线性化的慢病毒表达载体pLVX-EGFP-3FLAG-Puro重组。重组质粒转化DH5α感受态细胞。菌落PCR鉴定转化子，阳性克隆测序无误后，质粒共转染293FT细胞制备慢病毒。Real-time定量PCR法检测病毒滴度。Westernblot检测TRADD-GFP-FLAG融合蛋白的表达。MTT法检测TRADD基因慢病毒对增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响。结果菌落PCR扩增产物经凝胶电泳，阳性克隆得到1200bp片段，基因测序显示重组质粒中TRADD序列与GenBank中序列一致。包装产生的慢病毒转染293FT细胞48h后，荧光显微镜下可见大量绿色荧光，病毒滴度为3.22×108IU/ml，Westernblot检测到融合蛋白TRADD-GFP-FLAG在293FT细胞中获得有效表达，MTT法证实该融合蛋白具有生物活性，能有效抑制瘢痕成纤维细胞增殖。结论成功构建并包装了pLVX-TRADD-EGFP-3FLAG-Puro慢病毒表达载体，其可明显抑制增生性瘢痕成纤维细胞的增殖。