串联亲和纯化技术筛选肠病毒71型3D聚合酶的相互作用蛋白

目的利用串联亲和纯化技术筛选与肠病毒71型3D聚合酶相互作用的宿主细胞蛋白。方法利用RT-PCR方法从EV71BrCr株全基因组中获得3D聚合酶全长基因，构建pcDNA3.0-3D-Flag-HA真核表达载体并转染RD细胞，48h后收集细胞。用Westernblot方法检测3D蛋白在RD细胞内的表达情况。串联亲和纯化技术筛选与3D聚合酶相互作用的宿主蛋白并进行质谱分析,确定与3D聚合酶相互作用的蛋白或多肽。并采用免疫共沉淀实验，对候选蛋白CyclinG1与3D的相互作用进行验证。结果成功构建了pcDNA3.0-3D-Flag-HA载体，在RD细胞内检测到3D蛋白的表达。经串联亲和纯化和质谱分析得到LATS2、Nek2、APC5、CyclinG1、PI3K等一系列参与细胞凋亡及细胞周期调控的蛋白。免疫共沉淀实验证实3D蛋白与CyclinG1的相互作用。结论3D聚合酶可能与宿主细胞内蛋白相互作用，引起细胞凋亡及细胞周期改变。