一种具有双嗜性功能融合蛋白FN/CDH的制备及其促粘附、成骨生物活性鉴定

目的构建一种具有同嗜性和异嗜性细胞粘附功能的重组融合蛋白FN/CDH，验证其对人骨髓间充质干细胞(humanmesenchymalstemcell,hMSCs)的促粘附、成骨效能。方法以纤维连接蛋白(fibronectin,FN)和钙粘附蛋白11(CDH11)作为前体分子，通过生物信息学分析了解其结构序列与功能基团。采用“同源模建”作为分子模拟策略确定FN和CDH11功能片段的接合方式。常规PCR扩增FNⅢ7-10和CDH11EC1-2基因片段后应用重叠延伸PCR(splice-over-extensionPCR,SOE-PCR)进行基因拼接。将融合基因插入原核表达载体pET-22b构建重组载体,重组载体转化表达菌株Rsoetta-gami(DE3)，实现rFN/CDH的诱导表达，蛋白纯化。免疫印迹确定融合蛋白种属，离心促粘附实验和成骨诱导验证rFN/CDH体外生物活性。结果成功构建了pET22b-FNⅢ7-10/CDH11EC1-2融合基因原核表达载体，获得了rFN/CDH的可溶性表达，纯化后rFN/CDH的纯度达到96%。初步验证了各个融合蛋白表达属性的准确性，证实rFN/CDH具有良好的促进成骨细胞粘附的生物活性。将有成骨分化潜能的hMSCs在rFN/CDH涂层的TCPS表面进行成骨诱导培养，以早期成骨标志物Alkalinephosphatase(ALP)和晚期标志物Osteocalcin(OCN)作为评价指标，提示rFN/CDH具有良好的促进细胞成骨分化的生物活性。结论成功进行了rFN/CDH融合蛋白的原核表达、纯化和鉴定，嵌合蛋白的粘附活性在一定程度上实现了对FN和CDH11功能的叠加，rFN/CDH具有“促粘”和“促成骨”的双重生物活性，可作为一种理想的仿生修饰分子进行生物界面的构建。