双循环线性滚环扩增检测HBV替诺福韦耐药位点的方法学研究

目的探讨双循环线性滚环扩增（rollingcircleamplification，RCA）检测HBV替诺福韦耐药基因突变位点的可行性。方法以HBV替诺福韦耐药基因突变位点为检测靶点，设计该位点的锁式探针以及包括该位点的HBV野生型、突变性模板。锁式探针与野生型模板特异识别并结合，通过E.coli连接酶连接为闭合环形结构，加入引物启动第1轮RCA；扩增产物用HpaⅠ酶切游离出检测模板，重复上述过程进行第2轮RCA，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物；并对该方法的特异性、检测限及连接效率的影响因素进行初步探讨。结果探针与模板的杂交温度为45℃时，探针的环化连接效率最高、特异性最好。通过对不同浓度野生型模板的检测，单循环RCA的检测限为50pmol/L，双循环RCA的检测限为5pmol/L，检测灵敏度提高了10倍。结论初步建立了检测HBV替诺福韦基因耐药位点突变的双循环RCA方法。