A20人工锌指转录因子真核载体的构建及其对内皮细胞炎症反应的影响

目的观察A20基因的人工锌指转录因子（zincfinger-artificialtranscriptionfactor,ZF-ATF）对内源性A20基因及内皮细胞炎症反应的影响。方法根据人A20基因的序列，设计出其ZF-ATF,合成靶序列OligoDNA,退火形成双链DNA，与通过BamHⅠ和KpnⅠ酶切后的载体连接产生ZF-ATF真核载体,质粒转化感受态细菌DH5α，筛选阳性克隆，提取质粒，限制性内切酶酶切鉴定，鉴定阳性克隆进行测序。质粒DNA转染人脐静脉内皮细胞（humanumbilicalveinendothelialcell，HUVEC），通过Westernblot检测A20蛋白的表达，用脂多糖（LPS）诱导HUVEC细胞产生炎症反应，利用Westernblot检测NF-κBp65的表达情况，利用ELISA检测TNF-α、IL-6、IL-8等的水平。结果限制性内切酶酶切鉴定与DNA测序证实合成的含ATF的真核载体寡核苷酸链插入正确，Westernblot证实转染HUVEC后A20蛋白表达显著增加。ELISA法检测结果表明，在LPS刺激后，空载体组及空白组细胞因子IL-8、IL-6、TNF-α表达均明显上调，而ZF-ATF转染组没有明显上调，与空载体组及空白组比较，有统计学差异（P<0.05，P<0.01）；Westernblot证实在LPS刺激后ZF-ATF转染组NF-κBp65的表达（19.8±4.5）较空载体组（90.2±5.9）及空白组（96.3±3.3）显著下调（P<0.01）。结论成功构建人工锌指转录因子真核表达载体，且能够启动内源性A20的稳定表达，并发挥其抗炎等作用。