肝癌干细胞样细胞的分离及其耐药性受PI3K/Akt通路调节

目的分离肝癌干细胞样细胞，初步探讨PI3K/Akt通路调节其对化疗药物阿霉素的敏感性。方法将人肝癌细胞株PLC、HepG2、Hep3B置于无血清条件培养基中培养，形成细胞球，选用PLC细胞株进行后续实验。采用流式细胞仪、克隆形成实验、SCID小鼠体内成瘤实验鉴定PLC细胞球（肝癌干细胞样细胞）的肿瘤干细胞特性。MTT法、流式细胞仪测定PLC细胞球对化疗药物阿霉素的敏感性。流式细胞仪分析加入PI3K/Akt通路特异性抑制剂LY294002、阿霉素共同孵育细胞球后，其凋亡率的变化。Westernblot法比较PLC细胞球、PLC贴壁细胞中p-Akt1(Ser473)蛋白分子表达量及加入抑制剂LY294002作用于细胞球后，p-Akt1(Ser473)、Akt1蛋白分子表达量的变化。结果肝癌干细胞标志物CD90在细胞球中的表达较贴壁细胞显著升高（P<0.01）。细胞球的克隆形成数目（123.00±28.48）为贴壁细胞（56.33±7.37）的2.18倍（P<0.05）。同样细胞数接种于SCID小鼠皮下7周后，细胞球的致瘤率明显大于贴壁细胞。以5μg/mL的阿霉素分别处理细胞球和贴壁细胞48h后，细胞球的增殖率明显高于贴壁细胞[（71.83±12.30）%vs（45.68±5.95）%,P<0.05]，凋亡率显著低于贴壁细胞[（11.73±3.77）%vs（41.22±6.73）%,P<0.01]，而以阿霉素5μg/mL和LY294002共同孵育细胞球后，其凋亡率[（35.44±6.65）%]显著增加（P<0.01）。Westernblot检测到细胞球的p-Akt1(Ser473)蛋白分子表达量显著高于贴壁细胞（P<0.01），加入抑制剂LY294002处理细胞球后，p-Akt1(Ser473)蛋白表达量明显降低(P<0.05)，Akt1的表达量无明显变化(P>0.05)。结论肝癌干细胞样细胞对化疗药物阿霉素具有耐药性，其耐药机制与Akt信号通路第473位点磷酸化Akt1分子有关。