PNPase调控线粒体microRNA对线粒体DNA的保护作用

目的探讨抑制PNPase表达对线粒体microRNA（MitomiRs）表达的影响以及对线粒体DNA的保护作用。方法以人肝癌细胞SK-Hep1、HepG2和人骨肉瘤细胞U2OS为研究对象，用带绿色荧光蛋白的（greenfluorescentprotein,GFP）PNPaseshRNA慢病毒转染细胞，采用Westernblot方法检测PNPase表达。分离细胞线粒体、提取线粒体RNA、microRNA芯片检测下调PNPase前后线粒体microRNA（MitomiRs）种类的变化；Q-PCR检测mtDNA损伤频率、ELISA方法检测线粒体8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）。结果激光共聚焦显微镜观察显示，SK-Hep1、HepG2和U2OS细胞转染空载体病毒及PNPaseshRNA慢病毒转染后12～24h可见明显的绿色荧光。当MOI（转染复数）=20时，3种细胞的慢病毒转染效率达80％以上。连续观察2周，转染效率仍维持在70％~80％。Westernblot检测结果显示PNPaseshRNA组细胞PNPase蛋白表达低于正常对照组及阴性对照组。microRNA芯片显示：PNPaseshRNA后目的细胞MitomiRs表达谱发生明显变化，miR-30c-2-3p、miR-494、miR-1273g-3p、miR-4443表达上调，而miR-324-3p、miR-574-5p、miR-371b-5p、miR-6068、miR-21-5p表达下调。Q-PCR检测显示PNPaseshRNA组细胞mtDNA损伤频率减少。ELISA结果显示PNPaseshRNA组线粒体8-OHdG含量下降。结论抑制肿瘤细胞线粒体PNPase表达可导致MitomiRs表达谱发生变化，同时，肿瘤细胞mtDNA损伤减少，提示MitomiRs可能参与了mtDNA复制的调控。