HBV人工转录因子的制备及其靶向抑制HBV增强子活性研究

目的构建可靶向性识别HBV增强子的锌指蛋白人工转录因子真核表达载体，检测其在真核细胞内的表达、对细胞增殖影响及生物学活性分析。方法应用锌指蛋白（zincfingerprotein，ZFP）设计工具Zincfingertools3.0获取人工转录因子（artificialtranscriptionfactor，ATF）结合结构域并融合抑制性效应结构域KRAB，全基因合成ATF克隆进真核表达载pcDNA3.1(+)，酶切、测序来鉴定构建载体的正确性，X-tremeGENEHP转染pcDNA3.1-ATF于HepG2细胞，采用RT-PCR、免疫荧光及Westernblot检测ATFmRNA与蛋白的表达情况；CCK-8检测不同浓度的ATF表达载体转染后对细胞增殖的影响；双荧光素酶报告基因检测ATF对HBV增强子序列的靶向性抑制作用。结果成功构建pcDNA3.1-ATF真核表达载体；在HepG2细胞中能够正常表达；CCK-8检测ATF对细胞增殖生长无明显的毒性作用；双荧光素酶报告基因分析ATF能靶向性结合增强子并抑制报告基因的表达。结论通过基因工程的方法构建pcDNA3.1-ATF的真核表达载体可正常表达且无明显细胞毒性作用，可靶向性识别HBV增强子并具有相应的生物学活性。