Disulfiram联合Cu通过上调TNF-α表达及蓄积ROS诱导白血病干细胞凋亡

目的探讨Disulfiram联合Cu（DS/Cu）诱导急性髓系白血病（acutemyeloblasticleukemia,AML)细胞凋亡及其相关分子机制。方法磁珠筛选CD34+CD38-的KG1α细胞作为AML干细胞，流式细胞术检测空白对照组、DS单药组（5μmol/L）、DS/Cu组（5μmol/L/0.5μmol/L）、DS/Cu+NAC组（5μmol/L/0.5μmol/L/10mmol/L）的AML干细胞24h后凋亡比率及ROS水平；qRT-PCR检测上述各组TNF-α、CD40、TNFRSF11B、TNFRSF1B、HRK凋亡相关基因mRNA表达水平；Westernblot检测各组处理后TNF-α的蛋白表达水平；予以中和抗体TNF-αmAb(2μg/mL)和对照抗体IgG(2μg/mL)预处理2h后，流式细胞术检测空白对照组、DS/Cu组、TNF-αmAb组、TNF-αmAb+DS/Cu组、IgG组及IgG+DS/Cu组的AML干细胞24h后的ROS水平。结果予以DS或DS/Cu处理CD34+CD38-KG1α细胞后，细胞凋亡率由空白对照组的(6.65±0.64)%分别上升至(11.87±1.30)%、(27.43±1.65)%，差异均具有显著性统计学意义（P=0.01和P<0.01）；CD34+CD38-KG1α细胞ROS也分别上升了(1.39±0.12)倍和(2.81±0.11)倍，差异也具有统计学意义（P<0.03和P<0.01），并且DS/Cu组比DS组更明显（P=0.00）；应用NAC抑制DS/Cu诱导ROS蓄积后，细胞凋亡率由(27.43±1.65)%下降到(12.37±0.85)%（P<0.01）。qRT-PCR结果显示DS及DS/Cu均上调TNF-α、CD40、TNFRSF1B、TNFRSF11B、HRK凋亡相关基因的mRNA水平（P<0.05），且DS/Cu组较DS组上调的更明显（P<0.05），但是予以NAC预处理2h后，仅TNF-α基因水平依然高表达（P=0.73），而CD40、TNFRSF11B、TNFRSF1B、HRK基因水平均明显下调（P<0.05）。为进一步证实TNF-α作用，分别予以TNF-αmAb(2μg/mL)或IgG(2μg/mL)预处理2h后，TNF-αmAb+DS/Cu组相比DS/Cu组的ROS相对变化率由(2.78±0.25)倍下降到(1.28±0.17)倍（P=0.00），而IgG+DS/Cu组相比DS/Cu组的ROS相对变化率无显著性差异（P=0.23），TNF-αmAb及IgG组相比空白对照组的ROS水平无显著性差异（P=0.09和P=0.50）。结论DS/Cu可通过上调TNF-α表达及蓄积ROS诱导AML干细胞凋亡。