北京油鸡ADSL基因的克隆、表达及其结构与功能分析

采用RT-PCR与RACE方法扩增出北京油鸡腺苷酸琥珀酸裂解酶（ADSL）基因全长cDNA序列，亚克隆和序列分析结果表明：该基因开放阅读框长为1455个碱基，编码485个氨基酸；5′端非转录调控区具有典型管家基因的特征，在临近起始密码子－28号碱基发生C→T突变，该突变使得本来不是核呼吸因子2（NRF-2）结合位点的CTCC突变为NRF-2结合位点CTTC。将ADSL基因完整开放阅读框重组至融合表达载体pGEX-4T-1中，构建成北京油鸡ADSL基因融合表达载体pGEX-ADSL，转化大肠杆菌BL21（DE3），筛选阳性克隆，IPTG诱导表达。经SDS-PAGE电泳显示重组融合蛋白在约80.5kD处有特异蛋白条带出现，与预期分子量大小一致，等电点为6.79。该蛋白的表达量随诱导时间的延长而增加，5h达最高值，达到细胞总蛋白的26.9％,且主要以不可溶的包涵体形式存在，经优化表达条件，成功地获得了可溶性的融合蛋白，经GlutathioneSepharase4B凝胶纯化后用Westernblotting检测表明其为北京油鸡ADSL蛋白，为其进一步的生物学功能及其应用研究鉴定基础。