体细胞核移植生产绵羊转hALP基因囊胚

扩增人肝细胞再生增强因子(humanaugmenterofliverregeneration,ALR)基因,利用质粒pIRES2-EGFP构建新霉素(Neo)、增强绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescenceprotein,EGFP)双标记基因且EGFP和ALR基因为双顺反子的真核表达载体。LipofectAMINETM介导其转染体外培养的绵羊胎儿成纤维细胞(Sheepfetalfibroblastcells,sFFCs);经G418筛选转基因细胞;激光共聚焦显微镜挑选绿色荧光单克隆细胞。PCR、RT-PCR和免疫组织化学方法进一步检测ALR基因及其表达;稳定表达外源基因的sFFCs作供体,移入去核的绵羊卵母细胞中,进行体细胞核移植。通过激光共聚焦显微镜和ALR抗体检测EGFP、ALR基因在胚胎水平上的表达，其结果表明：由IRES连接的EGFP和ALR基因可在绵羊胎儿成纤维细胞内同时表达，由此细胞核移植产生的转基因胚胎在发育的各阶段均可见绿色荧光;囊胚中所有细胞表达EGFP基因;发绿色荧光的胚胎中ALR基因同时存在。因此，由IRES连接标记基因和目的基因,以标记基因指示目的基因的表达,可简化检测目的基因的繁琐手段;用筛选的转基因早期胚胎进行移植,可提高制备转基因动物的效率。