人乳头瘤病毒重组质粒的构建及蛋白表达

？目的构建重组原核表达质粒获得人乳头瘤病毒18型L1片段(HPV18L1)活性蛋白,为进一步研制人乳头瘤病毒18型(HPV18)基因工程疫苗打下基础。方法以重组质粒(pBR322-HPV18)为模板,利用PCR方法扩增HPV18L1DNA片段,将HPV18L1DNA与质粒(pUC19)重组构建重组质粒(pUC19-HPV18L1)。用酶切电泳验证重组结果的正确性;并通过测序检查质粒重组后序列有无变化。再利用质粒(pQE32)做表达载体构建重组质粒(pQE32-HPV18L1),并用酶切电泳验证。将重组质粒pQE32-HPV18L1转入工程菌(M15),用酶切电泳验证重组工程菌(pQE32-HPV18L1/M15)正确性。利用SDS-聚丙酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测HPV18L1目的蛋白。采用不同浓度异丙基-β-D-半乳糖苷(IPTG)、不同诱导时间来优化HPV18L1目的蛋白表达条件。利用Western印迹检测蛋白质(Westernblot)鉴定HPV18L1目的蛋白的特异性。结果PCR扩增DNA片段约为17Kb,与预期结果相同。克隆重组质粒pUC19-HPV18L1酶切后显示的酶切图谱与预期相同,而且测序验证插入片段全序列无改变。表达重组质粒pQE32-HPV18L1酶切图谱亦与预期相同。蛋白表达条件优化结果为1mmol/LIPTG诱导4h后,获得HPV18L1最佳蛋白表达量:SDS-PAGE显示,约63KD处可见目的蛋白带