禽流感病毒H5N1抗原基因克隆及体外转录

？目的通过基因克隆和体外转录,获得H5N1禽流感病毒抗原基因的RNA全长片段,为病原学检测提供阳性定量标准品.方法设计H5N1禽流感病毒血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)及基质蛋白M(M)的基因克隆引物,RT-PCR从病毒RNA获得相应片段,分别连接至pGEM-TEasy质粒并筛选阳性重组质粒,测序鉴定后酶切线性化,用T7RNA聚合酶进行体外转录,产物用DNase酶处理、纯化后测定浓度,RT-PCR验证.结果获得含H5N1禽流感病毒HA、NA、M全长基因序列的RNA片段,并可准确定量其拷贝数,质量浓度HA为503.9ng/μL、NA为379.2ng/μL、M为437.8ng/μL.结论获得的RNA片段可作为H5N1禽流感病毒核酸快速检测方法的阳性定量标准品.