副溶血弧菌tlh基因克隆载体和表达载体的构建

？目的构建含副溶血弧菌(vibrioparahaemolyticus,VP)tlh基因克隆载体和表达载体,检测并鉴定表达载体在转化菌的表达,为制备单抗、诊断试剂及进一步深入研究不耐热性溶血毒素(TLH)的功能奠定基础.方法根据Genbank的tlh全基因序列,设计一对附加EcorⅤ和HindⅢ两个限制性内切酶酶切位点的特异性引物,以VP基因组DNA为模板,用高保真Taq酶扩增出tlh基因.连接pGEM-T载体构建克隆载体,测序鉴定后,再用EcorⅤ和HindⅢ酶切回收目的基因并克隆至表达载体pET32a+,采用PCR和双酶切鉴定筛选阳性质粒,转化DE3,IPTG诱导,用SDS-PAGE检测tlh的表达.结果扩增的目的基因与GenBank的tlh比较具有99%的同源性,重组表达载体转化DE3,能表达融合蛋白.结论本研究成功扩增出完整的tlh基因,构建了克隆载体和表达载体,获得融合表达的目的蛋白.