人LMP-1基因腺病毒重组体的构建及其在骨肉瘤细胞U2OS中的表达

目的：构建表达人LIM矿化蛋白-1（LIMmineralizationprotein-1，LMP-1）基因的腺病毒重组体，体外感染骨肉瘤（Osteosarcoma，OS）细胞系U2OS，并鉴定LMP-1基因在U2OS中的表达。方法：以K562细胞的cDNA为文库，采用PCR方法对LMP-1进行扩增，通过TA克隆与pGEM-T载体连接并DNA测序。双酶切后并将目的基因插入至腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV，对腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV-LMP-1行双酶切和DNA测序鉴定，并通过荧光显微镜、RT-qPCR和Westernblot检测pAdtrack-CMV-LMP-1在HEK-293T细胞中的表达。线性化pAdtrack-CMV-LMP-1，在BJ5183菌内完成与骨架质粒pAdeasy-1的同源重组，构建重组腺病毒质粒Ad-LMP-1。通过脂质体介导，在HEK-293A细胞内包装出复制缺陷的重组腺病毒Ad-LMP-1，大量扩增、纯化并测定滴度。用Ad-LMP-1感染OS细胞系U2OS，通过荧光显微镜、RT-qPCR和Westernblot检测LMP-1在U2OS细胞中的表达。结果：双酶切和DNA测序鉴定穿梭质粒pAdtrack-CMV-LMP-1构建成功，荧光显微镜证实转染了pAdtrack-CMV-LMP-1质粒的HEK-293T细胞内有绿色荧光蛋白表达，RT-qPCR和Westernblot验证了LMP-1基因的表达量明显高于对照组。通过扩增、纯化，Ad-LMP-1滴度达到1.5×109pfu/ml。荧光显微镜下观察重组腺病毒感染的U2OS内有绿色荧光蛋白表达，RT-qPCR和Westernblot检测发现重组腺病毒感染U2OS后，LMP-1的mRNA和蛋白表达量明显高于对照组。结论：成功构建了人LMP-1基因腺病毒重组体，为进一步的实验研究奠定了基础。