体外培养细胞内乙肝病毒共价闭合环状DNA检测方法的建立

目的：建立一种体外培养细胞内乙肝病毒（hepatitisBvirus，HBV）共价闭合环状DNA（covalentlyclosedcircularDNA，cccDNA）的检测方法。方法：Southernblot检测HBV复制中间体，以确认HepAD38、HepG2.2.15和P+P-细胞是否支持HBV复制；用Hirt法分别提取细胞内的去蛋白DNA（protein-freeDNA，PFDNA），经加热变性处理，EcoRⅠ酶切，然后用Southernblot检测HBVcccDNA；用同样方法检测不同培养时间的HepAD38细胞内cccDNA，观察培养时间对cccDNA积累量的影响。结果：用Southernblot可在HepAD38、HepG2.2.15和PP-细胞中检测到HBV复制中间体；Hirt法提取物经变性和酶切处理，可有效地将cccDNA与其他形式HBVDNA区分开；HepAD38、HepG2.2.15和PP-细胞内均可检测到HBVcccDNA；HepAD38细胞在铺满后继续培养的时间较长时，其细胞内cccDNA的量较多。结论：成功建立了体外培养细胞内HBVcccDNA检测方法，该方法结合Hirt提取法和地高辛探针Southernblot方法，能可靠、准确地检测HBVcccDNA。