HBx-shRNA重组腺病毒的构建及功能鉴定

目的：构建携带绿色荧光蛋白（greenfluorescenceprotein，GFP）标签的乙型肝炎病毒X蛋白（hepatitisBvirusXpro－tein，HBx）特异性shRNA重组腺病毒，并对其干扰效果进行鉴定。方法：将前期构建的真核表达载体pGenesil-1-HBx-shRNA和pGenesil-1-Scramblesequence的表达启动子U6连同shRNA亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV，构建pAdTrack-CMV-U6-HBx-shRNA和对照pAdTrack-CMV-U6-Scramblesequence穿梭质粒；酶切及DNA测序鉴定后，经PmeⅠ线性化后转化入感受态AdEasier细菌，获得重组腺病毒质粒pAd-U6-HBx-shRNA和pAd-U6-Scramblesequence，PacⅠ酶切后转染AD293细胞获得重组腺病毒Ad-U6-HBx-shRNA和Ad-U6-Scramblesequence；扩增病毒，测定滴度；以RT-PCR和real-timePCR鉴定重组腺病毒Ad-U6-HBx-shRNA对HBx的干扰效果。结果：酶切鉴定得到阳性pAd-U6-HBx-shRNA和pAd-U6-Scramblesequence重组质粒；转染到AD293细胞并包装成功；RT-PCR以及real-timePCR表明，重组腺病毒Ad-U6-HBx-shRNA携带的干扰片段能够明显干扰HBx表达（P=0.01）。结论：成功构建了HBx特异性shRNA重组腺病毒Ad-U6-HBx-shRNA，它能抑制HepG2.2.15细胞中的HBx的表达，为研究HBx作为肝癌基因治疗作用的一个靶点以及机制奠定基础。