pri-mir-302/367重组慢病毒载体的构建及其下游调节基因的鉴定

目的：构建可诱导表达pri-mir-302/367的慢病毒载体，并研究miR-302/367家族基因miＲ-302a/b/c/d和miＲ-367及其下游调节基因OCT4、SOX2和NANOG在HeLa细胞中的诱导性表达。方法：以正常人基因组DNA为模板，PCR扩增pri-mir-302/367基因。经双酶切后连接入pLV-TRE质粒，构建pLV-TRE-302慢病毒重组体，酶切及测序予以鉴定。将重组质粒和辅助质粒共同转染293FT细胞，并测定病毒滴度。用病毒转染HeLa细胞，强力霉素（doxycline，DOX）诱导后，通过real-timePCR测定miR-302/367家族基因及其下游调节基因的表达。实验分为诱导组（DOX+）、非诱导组（DOX-）和空白组（blank）。结果：酶切及测序证实重组慢病毒载体pri-mir-302/367构建成功，病毒滴度为5×106TU/ml；DOX诱导72h后，real-timePCR结果显示诱导组高于非诱导组和空白组（P＜0.05，其中miR-302a：PDOXvs.DOX-=0.032，PDOXvs.blank=0.048；miR-302b：PDOXvs.DOX-=0.001，PDOXvs.blank=0.001；miR-302c：PDOXvs.DOX-=0.000，PDOXvs.blank=0.000；miR-302d：PDOXvs.DOX-=0.002，PDOXvs.blank=0.047；miR-367：PDOXvs.DOX-=0.001，PDOXvs.blank=0.001；OCT4：PDOXvs.DOX-=0.000，PDOXvs.blank=0.001；SOX2：PDOXvs.DOX-=0.000，PDOXvs.blank=0.000；NANOG：PDOXvs.DOX-=0.000，PDOXvs.blank=0.000），而非诱导组与空白组相比差异无统计学意义（P＞0.05，其中miR-302a：Pblankvs.DOX-=0.057；miR-302b：Pblankvs.DOX-=0.832；miR-302c：Pblankvs.DOX-=0.445；miR-302d：Pblankvs.DOX-=0.979；miR-367：Pblankvs.DOX-=0.161；OCT4：Pblankvs.DOX-=0.051；SOX2：Pblankvs.DOX-=0.060；NANOG：Pblankvs.DOX-=0.078）。结论：成功构建了携带人miR-302/367可控性慢病毒载体，为后续的重编程研究奠定了实验基础。