Let-7a稳定转染尤文肉瘤细胞系的建立

目的：构建携带let-7a基因的真核表达载体，建立稳定转染该质粒的尤文肉瘤（Ewing’ssarcoma，ES）细胞株A673/let-7a、SK-ES-1/let-7a。方法：通过Gateway克隆技术，扩增attB1-K-eGFP-let-7a-1-attB2片段，与pDONR221进行BP重组反应产生入门克隆，再与母载体———pLV.Des2d.P/neo进行LR重组反应，生成目的质粒———pLV.Des2d.P/neo-EF1A>eGFP/let-7a；通过PCR及测序验证目的质粒；将携带let-7a的重组慢病毒质粒稳定转染ES细胞株A673和SK-ES-1获得A673/let-7a、SK-ES-1/let-7a细胞株；通过real-timePCR检测稳定转染细胞株内let-7a的表达水平，Westernblot检测其靶基因CDK6的表达。结果：PCR证实获得的目的条带与理论值相符，测序分析证实携带let-7a的真核表达载体插入序列及位点正确；real-timePCR及Westernblot检测结果显示，与转染空载质粒及未处理组的A673、SK-ES-1细胞株相比，稳定转染重组目的基因的A673/let-7a、SK-ES-1/let-7a细胞高表达let-7a，分别达到8.5倍（P=0.000）和6.5倍（P=0.001），差异具有统计学意义；且细胞内let-7a靶基因CDK6的表达量明显减少。结论：成功构建稳定表达let-7a的ES细胞株A673/let-7a、SK-ES-1/let-7a。