携带siRbpj重组腺病毒载体的构建及其对BMP9诱导骨髓间充质干细胞成骨分化作用影响

目的：构建并筛选特异性干扰Notch信号通路核转录因子Rbpj基因的重组腺病毒，探讨通过Rbpj的经典Notch信号通路在骨形态发生蛋白（bonemorphogeneticprotein，BMP）9诱导骨髓间充质干细胞（mesenchymalstemcells，ＭＳＣs）成骨分化中的作用。方法：设计3对针对小鼠Rbpj的siRNA序列，将其分别亚克隆至pSES-HUS穿梭质粒，再与骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183内同源重组获得重组质粒，经脂质体转染至HEK293细胞中包装扩增腺病毒，利用RT-PCR及Westernblot进行筛选、验证有效的干扰腺病毒。该重组腺病毒与AdBMP9处理ＭＳＣs细胞株C3H10T1/2，采用组织化学和RT-PCR检测早期成骨指标碱性磷酸酶（alkalinephosphatase，ALP）和晚期成骨指标骨桥蛋白（osteopontin，OPN），骨钙蛋白（osteocalcin，OCN）及BMP下游靶基因Id1、Runx2等的表达。结果：成功构建了3个重组腺病毒，并筛选出干扰效率最好的AdsiRbpj-2重组腺病毒，转染C3H10T1/2，AdsiRbpj-2可以明显下调BMP9诱导的早期成骨指标ALP的活性及晚期成骨指标OPN、OCN的表达，成骨相关基因Runx2等的表达也有下降。结论：成功构建了特异性阻断Notch经典信号通路腺病毒载体AdsiRbpj-2，该重组腺病毒能够抑制BMP9诱导的C3H10T1/2细胞的成骨分化进程，从而进一步证明Notch信号通路在BMP9诱导的MSCs成骨分化过程中有着重要的作用。