过表达人TSHR-A亚单位的重组腺病毒Ad-TSHR289/6xHis载体构建与鉴定

目的：构建以促甲状腺激素受体（thyroidstimulatinghormonereceptor，TSHR）A亚单位（TSHR289）基因片段为免疫原的重组腺病毒载体，以期建立Graves病（Graves’sdisease，ＧＤ）动物模型，为探讨中药复方对GＤ的防治作用提供条件。方法：利用重叠PCR技术从pSV2neoECE-TSHR289-6H-dhfr质粒中将目的基因TSHR289扩增至载体attB1-Kozak-TSHR289/6xHis/IRES/eGFP-attB2，琼脂糖凝胶电泳回收，GatewayR技术构建重组腺病毒载体（pAV.EX1d-TSHR289/6xHis/IRES/eGFP，pAd-TSHR289/6xHis），转化到大肠杆菌Stbl3中，菌落PCR筛选阳性克隆、测序鉴定。将pAd-TSHR289/6xHis转染HEK293A细胞包装腺病毒，CsCl梯度离心法纯化腺病毒，TCID50法检测病毒滴度。RT-PCR法检测HEK293A中TSHR289的mRNA表达。应用该腺病毒免疫BALB/c小鼠制备GＤ模型。结果：菌落PCR筛选阳性克隆，测序证明构建正确；细胞感染腺病毒后出现明显细胞病变及增强型绿色荧光蛋白（enhancedgreenfluorescentprotein，eGFP）表达；RT-PCR检测证实重组腺病毒转染的细胞中TSHR289的mRNA表达量是未转染的285倍；实验测得病毒滴度为3.16×1010PFU/ml；BALB/c小鼠免疫第10周T4、TSHR抗体（TRAb）阳性率7/10。结论：成功构建了过表达人TSHR289基因的重组腺病毒载体，动物实验证明该腺病毒诱发自身免疫，产生TRAb。为下一步体内药物治疗GＤ试验提供了条件。