Clusterin基因沉默对脑胶质瘤U87细胞放射敏感性的影响

目的：研究通过慢病毒介导的RNA干扰技术沉默簇集蛋白（clusterin，CLU）基因表达对人脑胶质瘤U87细胞放射敏感性的影响。方法：设计和合成靶向CLU的短发夹RNA（shorthairprinRNA，shRNA）序列（CLUshRNA1，CLUshRNA2），并构建到慢病毒的载体plentilox3.7，以不针对任何基因的shRNA序列作为对照（对照shRNA）。包被能成功表达各种shRNA载体的慢病毒。将慢病毒感染人脑胶质瘤U87细胞，Real-timePCR法和Westernblot法测定CLUmRNA表达和蛋白质表达水平，证实干扰效果。给予不同放射剂量（2、4、6Gy）处理后，通过四甲基偶氮唑盐（thiazolylbluetetrazoliumbxomide，MTT）法及流式细胞仪AnnexinV/PI法检测脑胶质瘤U87细胞的存活率及凋亡率。Westernblot方法筛选多个凋亡相关信号分子的改变。结果：靶向CLU基因的shRNA特异性地抑制了CLUmRNA和蛋白质的表达。MTT实验结果显示实验干扰组细胞在不同放射剂量下的脑胶质瘤实验U87细胞的存活率与对照组比较明显下降，差异具有统计学意义（4Gy时，对照shRNAvs.CLUshRNA1：P=0.000，对照shRNAvs.CLUshRNA2：P=0.00３；6Gy时，对照shRNAvs.CLUshRNA1：P=0.000，对照shRNAvs.CLUshRNA2：P=0.000）。流式细胞仪AnnexinV/PI法检测结果表明：4Gy放疗后2个实验组细胞凋亡率均明显增加，最高达（35.54±0.95）%，较对照组高2倍多，差异具有明显统计学意义（对照shRNAvs.CLUshRNA1：P=0.000；对照shRNAvs.CLUshRNA2：P=0.000）。Westernblot法发现CLU沉默可以显著上调促凋亡分子Bax蛋白水平。结论：CLU基因沉默可能通过调控Bax蛋白的表达，明显增强脑胶质瘤U87细胞对放射的敏感性，有望成为增加脑胶质瘤放射敏感性的新靶点。