肺炎链球菌烯醇化酶与热休克蛋白DnaJ的结合及结合位点鉴定

目的：明确肺炎链球菌糖酵解关键酶烯醇化酶（enolase，Eno）和热休克蛋白DnaJ是否有直接结合及结合位点。方法：原核表达并纯化Eno全长蛋白，鉴定其酶活性，利用重组Eno蛋白皮下免疫昆明小鼠制备特异性抗血清，分析其胞外分泌情况；采用生物膜层干涉（biolayerinterferometrvy，BLI）技术和直接结合实验鉴定Eno和DnaJ两者之间是否存在直接相互作用；在前者结果阳性的基础上，截短表达Eno蛋白，通过直接结合实验鉴定Eno蛋白结合DnaJ的位点。结果：成功表达重组Eno蛋白，纯度达90%，该蛋白具有酶活性；重组Eno蛋白皮下免疫昆明小鼠后，获得效价达1∶7.68×106的特异性抗血清；Westernblot分析显示，7种不同血清型肺炎链球菌培养上清中均在分子量约47kD处出现特异性反应带；直接结合试验显示，随着Eno蛋白浓度增加，Eno与DnaJ的结合量也相应增加（r=0.920，P=0.000），其吸光度值从0.222±0.042（12.5μg/ml）增加到0.569±0.099（200.0μg/ml）；BLI技术测定两者结合的亲和常数为926nmol/L；截短的Eno（aa1～aa100）与DnaJ的结合量2.25±0.38高于其他截短序列的结合量0.94±0.25、1.08±0.09、0.75±0.12，差异具有统计学意义（P=0.000，P=0.001，P=0.000）。结论：肺炎链球菌Eno蛋白与DnaJ蛋白存在直接结合作用，结合位点主要位于其N端的1～100个氨基酸序列。