人肝再生增强因子真核表达及其对顺铂诱导肝癌细胞凋亡的影响

目的：构建人肝再生增强因子（humanaugmenterofliverregeneration，hALR）15kD亚型的真核表达系统，并探索ALR对顺铂（Cisplatin，DDP）诱导的人肝癌细胞株QGY凋亡的影响。方法：用聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）方法和基因重组技术，从重组质粒pPIC9K-rhALR中扩增出编码rhALR基因片段，将其克隆入pPICZαA质粒中构建重组质粒pPICZα－A-rhALR。重组质粒SacⅠ酶切线性化后电转入酵母GS115中，并在1%的甲醇诱导下表达。表达上清蛋白经Westernblot（ALR多克隆抗体和His-tag标签抗体）鉴定和镍柱亲和层析纯化。MTS试剂检测rhALR体外对人肝癌细胞（HepG2、QGY）的促增殖活性，及流式细胞仪检测rhALR在顺铂诱导QGY细胞凋亡中的抗凋亡作用。结果：PCR、双酶切、DNA测序均鉴定重组质粒构建与预期一致。分泌表达的rhALR约占上清总蛋白的70%，目的分子量约17kD，Westernblot均可见单一条带。纯化后的rhALR对HepG2和QGY的体外促增殖作用呈浓度依赖性增强（HepG2组：F=246.729，P=0.000；QGY组：F=246.004，P=0.000），且在QGY细胞顺铂诱导凋亡时也发挥着浓度梯度式抗凋亡作用（F=101.061，P=0.000）。结论：成功构建高效分泌表达rhALR的pPICZα－A-rhALRGS115真核表达系统；体外实验证实rhALR对顺铂诱导人肝癌细胞有呈浓度依赖性的抗凋亡作用。