小麦TILLING分析中CELⅠ酶切及PCR反应体系的优化

在小麦中建立稳定的基于CELI酶切的目的基因突变位点检测技术，有助于高通量鉴定目的基因片段的点突变及提高突变检测效率。本研究以冬小麦品种新麦18空间诱变SP2代群体为材料，以小麦糯质基因Waxy为目标片段，通过优化基因组DNA提取方法、调整PCR反应体?系中dNTP、Mg2及引物浓度、改变目标片段CELI酶切缓冲液成分，以及调整纯化过程中的空气相对湿度等方式，优化了小麦TILLING技术体系。在利用PVP-40法提取DNA过程中，研磨器振动频率提高到30/s，KAc溶液的反应时间延伸为20min时，基因组DNA质量和纯度最佳；在设定的浓度范围内dNTP和Mg2浓度对产物影响差异不明显，均能高效扩增出目的条带。引物浓度对产物影响差异显著，最佳引物浓度为0.4umolL-1。20？酶切体系中，最佳CELI酶浓度为0.1U且利用超纯水代替CELI缓冲液。最终在小麦中建立起了基于CELI酶切的高通量TILLING筛选技术体系。