田菁茎瘤固氮根瘤菌在小麦体内的定殖及营养元素相关miRNA的表达

【目的】随着化肥过度使用引起的环境问题的出现，无公害农业的推广，以及新型肥料研究领域不断拓宽，微生物肥料，尤其是植物根际促生菌的研究成为近年来的热点。然而微生物肥料的增产机理还基本停留在作物农学性状的表观调查上，没有从分子水平进行研究。因此，本文用田菁茎瘤固氮根瘤菌（AzorhizobiumcaulinodansORS571）侵染小麦，探索GFP-A.caulinodans在小麦幼苗组织中的分布与定殖规律以及营养元素相关miRNAs在小麦与A.caulinodans互作中的作用机制。【方法】使用A.caulinodans侵染小麦种子（品种为小偃22），将接菌6d后的小麦幼苗的根和接菌12d后的叶制作玻片，利用激光共聚焦显微镜对样品进行逐层扫描，检测GFP-A.caulinodans在幼苗不同组织中的分布与定殖情况。同时，采集接菌后0h、6h、12h、24h、48h、72h、96h的小麦幼根取样，用Trizol法提取总RNA。利用试剂盒进行加尾和反转录反应，将样品总RNA中的miRNA合成为cDNA，使用β-tubulin作为内参基因，进行实时定量PCR反应，使用2-ΔΔCT方法计算相对表达量。利用psRNATarget在线软件，采用默认参数，对miRNA的靶基因进行预测。【结果】1）激光共聚焦结果显示，GFP-A.caulinodans可定殖于根的表皮细胞、细胞间隙、根尖破损处和根毛，在根维管组织和叶片气孔部位，也发现有GFP-A.caulinodans存在。2）实时定量PCR分析结果表明，6条与营养元素代谢有关的miRNA表达发生变化，其中miR164、miR167和miR827相对表达量呈现出先上调后下调的趋势，miR169和miR398相对表达量也基本呈现出这一趋势。miR164、miR167、miR169和miR398的相对表达量在接菌12h时上调至最高点，分别为对照的4.13、2.84、2.46和3.99倍；miR827相对表达量在接菌24h时达到最高点，为对照的2.17倍。miR399相对表达量呈现出先下调后上调的趋势，在接菌24h时降至最低点，为对照的0~21倍。3）通过靶基因预测，6条miRNA的靶基因分别编码了NAC1转录因子、生长素响应因子、HAP转录因子、Cu/Zn超氧化物歧化酶、蛋白缀合酶PHO2和SPX-MFS亚家族蛋白。【结论】GFP-A.caulinodans能够从根毛和根尖破损处等部位进入小麦幼苗根部定殖，并可通过向上迁移到达叶片，在气孔处定殖。接种A.caulinodans可不同程度增加小麦根中响应氮素、磷素、微量元素的miRNAs相对表达量,增强小麦幼苗对营养元素的吸收和利用，促进小麦根的形态建成。