甘蓝花粉管钙感应蛋白cam与srk相互作用研究

为研究甘蓝花粉管钙感应蛋白cam与srk相互作用的分子机理及其可能相互作用的区域，从自交不亲和甘蓝材料‘e1’中分别克隆得到cam12基因450bp及s位点受体激酶（srk7）基因全长序列2118bp，并亚克隆得到srk胞外域（esrk）和胞内激酶域（isrk），构建原核表达载体pgex-cam12、pcold-esrk和pcold-isrk，转化e.colibl21（de3）进行原核表达，表达产物纯化后进行体外相互作用，结果表明cam12能够与srk7进行相互作用，但作用区域是isrk7而不是esrk7。为进一步验证其相互作用，本研究利用酵母双杂交系统，构建pgbkt7-cam12、pgadt7-esrk7、pgadt7-isrk7和pgadt7-srk7酵母表达载体，转化相应酵母y2hgold和y187感受态细胞后未出现自激活和毒性现象，相互作用结果与原核表达检测一致。同时将cam12的3个ef-hands结构域突变体cam12-2-、cam12-23-和cam12-234-与isrk7分别构建酵母表达载体pgadt7-cam12-2-、pgadt7-cam12-23-、pgadt7-cam12-234-，检测其相互作用。结果表明cam12ef-hands突变体cam12-2-、cam12-23-和cam12-234-在酵母双杂交系统中均不能与isrk7片段发生相互作用，说明cam12的ef-hands结构域突变后失去结合ca2+能力而不能与isrk7相互作用。该研究可为自交不亲和机理提供新的参考依据。关键