香蕉果实转录因子mawrky1基因的原核表达和多克隆抗体制备

mawrky1是从香蕉果实中克隆出的一个转录因子基因。为进一步研究该基因的功能，制备了mawrky1多克隆抗体。选取mawrky1基因全长中n端第168~400个氨基酸之间的包括两个wrkygqk保守域的cdna序列，构建了原核表达载体pet-mawrky1，并转化到大肠杆菌bl21中诱导表达菌体蛋白。sds-page电泳检测结果表明，his-mawrky1融合蛋白成功获得了高效表达，分子量在26kd左右。his-mawrky1融合蛋白经过ni-nta琼脂糖凝胶树脂纯化，sds-page制备胶割胶富集，电洗脱法纯化后得到的纯化蛋白浓度达到0.5mg？ml-1。经对新西兰兔进行5次免疫，获得了多克隆抗血清，采用免疫吸附方法对抗血清进行了纯化。将纯化后的抗体通过间接酶联免疫（elisa）和蛋白质印迹（westernblot）分析，表明所制备的抗体具有很好的效价，效价比为1︰160000，同时具有良好的灵敏度和特异性。进一步提取香蕉不同组织总蛋白，westernblot检测显示，在分子量26kd左右处出现特异的蛋白质条带，证明所制备的抗体可以与香蕉wrky蛋白特异性结合，并且低温可以诱导香蕉果实中mawrky1蛋白表达，暗示mawrky1蛋白表达可能与果实耐冷性有一定的关系。