马铃薯类病毒cdna双体探针的研制及其在检测上的应用

在马铃薯纺锤块茎类病毒(potatospindletuberviroid,pstvd)基因组中bamhⅰ位点处(87～92nt),设计两对含有bamhⅰ重叠区(overlop)的引物。将pcr扩增获得的全pstvd分别插入到pgm2t载体中。通过bamhⅰ位点,将两个pstvd单体连接,构建pstvd双体体。以此载体为模板,通过pcr标记技术,制备了高灵敏高专化的pstvd双cdna地高辛标记探针。以cdp-star为反应底物进行化学发光反应结果判读,建立了pstvd的高效杂交检测体系。该体系可以对马铃薯薯块、叶片、芽等不同组织样品进行检测,检测灵敏度达到0.05pg。通过对67份田间采集的样品和实验室保存的资源材料进行检测,比较了cdna双体探针核酸斑点杂交技术(nucleicacidspothybridization,nash)、反转录聚合酶链式反应(reverse-transcriptionalpolymerasechainreaction,rt-pcr)和往返—聚丙烯酰胺凝胶电泳(return-polyacrylamidegelelectrophoresis,r-page)检测技术的阳性样品检出率,结果显示,nash技术阳性样品检出率为67.7%,与rt2pcr相一致,高于r2page技术的阳性检测率(53.7%)。