芜菁二氢黄酮醇4–还原酶基因的克隆与功能鉴定

二氢黄酮醇4–还原酶（dihydroflavonol4-reductase，dfr）是花青素生物合成晚期阶段的关键酶，属于nad/nadp依赖型还原酶家族，催化从二氢黄酮醇转变成无色花色素苷的反应。利用uv-a处理‘津田’芜菁（‘tsuda’turnip）和‘赤丸’芜菁（‘yurugiakamaru’turnip）块根24h后提取总rna，通过rt-pcr方法分别克隆了‘津田’芜菁brdfr1和‘赤丸’芜菁brdfr2基因。brdfr1和brdfr2的开放读码框分别为1158bp和999bp，分别编码385和332个氨基酸。氨基酸序列分析显示，brdfr1和brdfr2与大白菜dfr具有高度同源性，从第8到第302位氨基酸的肽段具有fr_sdr_e结构域。brdfr1和brdfr2基因组全长序列均含有5个位置与序列完全相同的内含子。southern杂交结果显示，‘津田’芜菁brdfr1和‘赤丸’芜菁brdfr2基因均为单一拷贝。uv-a可以诱导brdfr1基因表达，对brdfr2基因表达的诱导效果不明显。brdfr1和brdfr2基因在大肠杆菌细胞中可以表达并纯化出分子量约为42.8kd的brdfr1蛋白和37.5kd的brdfr2蛋白。过量表达brdfr1和brdfr2基因的烟草花色加深。芜菁dfr基因的rnai载体遗传转化烟草后，转基因植株的花色变浅。这些工作将为阐明依光型和非依光型花青素生物合成机理奠定研究基础。