黄瓜动蛋白特异肽段的原核表达和多克隆抗体制备

以黄瓜果实总rna为模板，通过rt-pcr获得了动蛋白基因cskf1和cskf2的cdna序列，进行测序，构建t-easy载体。smart在线预测cskf1和cskf2均含有动蛋白（kinesin）约340个氨基酸残基的马达区保守序列（moterdomain）。体外表达蛋白的马达区和非马达区，将带有his标签的cskf1-n、cskf2-c、cskf1-m、cskf2-m融合蛋白通过e.colibl21（de3）表达，摸索不同诱导条件下目的蛋白的表达和纯化。其中his-cskf1-n、his-cskf2-c、his-cskf1-m原核表达蛋白的分子量分别为25、30和40kd，均以0.1mmol·l-1iptg，22℃6h诱导表达效果最好。his-cskf2-m原核表达蛋白的分子量约38kd，以18℃8h诱导表达效果最好。融合蛋白his-cskf1-n和his-cskf2-c经过亲和纯化后作为抗原，通过5轮免疫注射兔子后，取心脏血作为抗血清，通过aminolinkpluskit试剂盒亲和纯化得到多克隆抗体anti-cskf1-n和anti-cskf2-c。经过westernblot分析表明多克隆抗体具有特异性，可与抗原特异结合。