携带人凝血因子Ⅸ突变衍生物基因重组腺相关病毒的大量制备与体内外表达研究

构建了一系列携带有人凝血因子Ⅸ突变衍生物基因(hFⅨR338A)及不同调控元件的腺相关病毒表达载体,并经体外转导不同的细胞系,筛选、优化,挑取高表达质粒及其转导稳定细胞克隆,然后,以一个携带有腺相关病毒包装蛋白的rAAV/HSV杂合病毒包装系统介导进行重组腺相关病毒的大量制备,建立了可进行产业化制备的技术路线及高滴度、大量制备重组腺相关病毒的技术方法,所获得的重组病毒滴度达1.25×1012病毒颗粒/mL,然后,利用这一重组病毒,对rhFⅨR338A进行离体及在体表达,获得了rhFⅨR338A在肌细胞系C2C12及血友病B小鼠体内的高效表达,表达峰值分别达(2551.32±92.14)ng·(106细胞)-1·(24h)-1及463.28ng·mL-1,与野生型Ⅸ因子的表达水平(2565.76±64.36)ng·(106细胞)-1·(24h)-1及453.92ng·mL-1无显著性差异.然而,其凝血活性却成倍增加,约为后者的2.46倍.将人凝血因子Ⅸ突变衍生物基因引入血友病B基因治疗研究之中,同时,探讨了一个新的包装系统——rAAV/HSV杂合病毒包装系统——在重组AAV载体大量制备中的应用,为进一步利用重组AAV介导人凝血因子Ⅸ突变衍生物基因进行血友病B基因治疗的临床试验与产业化开发奠定了基础.