小麦PDS基因VIGS载体构建体系的优化及验证

为在小麦上进行VIGS体系的优化，根据GenBank中公布的小麦PDS基因序列（FJ517553.1）设计特异引物，利用RTPCR技术克隆PDS基因片段，以BSMV:γ2a为原载体，通过酶切将原载体中的2a基因片段替换为PDS基因片段，构建小麦PDS基因的VIGS重组载体BSMV:γPDS。经测序确认，其与GeneBank中登录的小麦PDS基因序列同源性为97%。重组载体经本实验室简化改良的方法进行转录模板的处理。与试剂盒所提供的方法相比，本研究将RNA酶孵育处理步骤整合入质粒提取的步骤中，省略了SDS蛋白酶K孵育处理等步骤，降低了引入新杂质的风险，同时降低了实验成本，节省了时间和精力。体外转录的电泳结果表明，体外转录反应的产物浓度大，条带单一，可用于接种实验。抽穗期小麦穗部接种实验及实时定量PCR的结果均表明，小麦内源PDS基因被有效沉默，证实了优化的重组载体BSMV:γPDS体系的有效性，奠定了利用VIGS载体侵染抽穗期小麦体系优化的基础。