基于pHY300PLK的分泌表达载体的构建

用PCR、酶切、连接方法将地衣芽孢杆菌耐高温α？淀粉酶基因(amy)表达单元(包括启动子、信号肽及淀粉酶基因)克隆到pHY300PLK中，并用反向PCR、同源重组方法，去除重组质粒的氨芐抗性基因，以利用α？淀粉酶基因的启动子和信号肽高效表达自身蛋白及外源蛋白。结果表明：连入了α？淀粉酶表达单元的pHY300PLK，即pAMY质粒能够分泌表达α？淀粉酶，且去除了氨苄抗性基因的pAMY质粒，即pAMY1质粒能更有效的表达α？淀粉酶；将纤维素酶基因连接到pAMY1质粒中淀粉酶信号肽的下游，得到的重组质粒pCEL能分泌表达纤维素酶，表明α？淀粉酶基因的启动子和信号肽不仅能启动自身蛋白的表达，也能启动外源蛋白的表达；重组菌的生长情况与质粒拷贝数的比较表明，与PAMY质粒相比去除了氨苄抗性基因的pAMY1质粒对重组菌的生长没有影响，且pAMY1质粒在重组菌的复制效率更高，能更高效的表达蛋白，以上结果证明pHY300PLK克隆质粒已成功改造成表达质粒，下一步可用于更多外源基因的分泌表达。