Pfu酶基因的克隆、表达、纯化及长距离PCR的研究

用PCR方法从Pyrococcusfuriosus的总DNA扩增出了含有PfuDNApolA基因的2.3kb片段,并将该基因克隆入pGEMT载体.用NcoⅠ和XhoⅠ对重组质粒pTpfu进行酶切,并将pfupolA基因插入表达载体pET3dX.在大肠杆菌BL21(DE3)中将pfupolA基因进行表达,然后用热变性、聚乙二胺(PEI)沉淀和Biorex70离子交换法对其基因产物(Pfu酶)进行纯化.用蛋白质N末端测序法证实了确为重组Pfu酶.利用重组Pfu酶,成功地用长距离PCR法扩增出大于10kb的λDNA片段.