荧光假单胞菌G2-EPSP合酶的拆分和intein介导的活性恢复

利用GPS-LS接点扫描系统,在荧光假单胞菌G2的5-磷酸烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶编码基因aroA中随机插入15bp(即编码5个氨基酸短肽)的外源片段,建立含一系列不同插入位点的aroA突变体库.利用内源aroA基因缺失的大肠杆菌突变株ER2799对突变体库进行功能互补筛选,测序后确定了12个可以忍受5个氨基酸插入的位点,其中位点F295/T296经SspDnaE内含肽(intein)介导的蛋白互补技术鉴定为可拆分和蛋白重建的位点.从位点F295/T296将G2-EPSPS基因一分而二,N-端和C-端片段分别连接在携带SspDnaE内含子元件的原核表达双质粒上,获得共转化质粒pMEPSN295IN和pKEPSC296IC.将质粒pMEPSN295IN和pKEPSC296IC分别或共转化内源aroA基因缺失的大肠杆菌突变株ER2799中,携带共转化质粒的重组子能够在M9限制性培养基生长,而携带单一质粒的不能生长,表明从位点F295/T296拆分的aroA基因在内含肽介导下实现了蛋白重建,在突变株ER2799中恢复了5-磷酸烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶活性,酶活水平达到野生型的62.92%,为4.48U/mg.