用酵母双杂交系统筛选与NifA相互作用的蛋白质

利用酵母双杂合系统从巴西固氮螺菌(Azospirillumbrasilense)Sp中筛选与NifA有直接相互作用的蛋白质因子.首先将nifA基因克隆到pGBD-C2载体上,构建成诱饵质粒pGBD-nifA,接着将巴西固氮螺菌的染色体DNA构建在pGAD-C1,pGAD-C2和pGAD-C3质粒载体上,形成3个质粒文库YSPC1,YSPC2和YSPC3.然后以pGBD-nifA为诱饵,对YSPC1,YSPC2和YSPC3这3个文库进行了筛选,得到11个阳性克隆.DNA序列分析表明,这11个阳性克隆分为4类,包含4个1~1.3kb不同的基因片段.对这4个基因片段进行同源性比较发现,其中2个编码的蛋白质含有与信号传递有关的PAS结构域,另外1个基因片段含有与吸收铁有关的fhuE基因,另一个是未知蛋白.将这4个基因片段从原来的pGAD载体转移到pGBD载体,即互换换载体后,它们仍然与NifA有相互作用;对这4个基因片段进行移码突变则不再与NifA有相互作用,说明了它们与NifA相互作用的特异性.