分泌改善的重链促进基于蛋白内含子的双载体共转全长FVⅢ基因

在甲型血友病基因治疗中,其疗效受FVⅢ的低分泌性和较大的FVⅢ基因难以为腺相关病毒(AAV)载体运载等因素的不利影响.研究表明,重链的分泌低下是导致FVⅢ分泌低效性的主要原因.我们最近的研究表明,应用蛋白质剪接技术的双载体转B区缺失型FVⅢ(BDD-FVⅢ)基因,通过表达后重链和轻链的共价连接,轻链可顺式促进剪接BDD-FVⅢ的分泌,但重链分泌的低下影响分泌的水平.本文将具有促进FVⅢ分泌作用的L303E/F309S点突变引入FVⅢ的重链,通过蛋白质剪接的双载体共转断裂全长FVⅢ基因,观察了重链和剪接全长FVⅢ的分泌和生物活性的变化.构建了一对融合SspDnaB蛋白内含子(intein)的突变重链和轻链真核表达载体,瞬时共转染培养的COS-7细胞,Westernblotting结果表明转基因细胞有明显的剪接FVⅢ蛋白表达;突变重链单独转基因后的分泌量为(39±11)ng/mL,明显高于野生型重链的分泌量;与轻链共转基因的重链分泌量增加到(123±13)ng/mL,培养上清中分泌的剪接FVⅢ量和活性分别为(86±14)ng/mL和(0.61±0.08)IU/mL,明显高于断裂的野生型FVⅢ共转基因.另外,转突变重链和轻链基因细胞的合并培养上清中亦检测到剪接的FVⅢ蛋白和生物活性,且高于转野生型重链和轻链基因细胞的合并培养上清.结果表明,重链分泌性的改善可提高运用蛋白质剪接技术的双载体转断裂的全长FVⅢ基因的功效,为动物体内进一步运用双AAV载体转全长FVⅢ基因提供了实验依据.